五步教你跑出漂亮的大分子western-blot圖訣竅
如果你的蛋白分子量大于150KD，但苦于一直跑不出好看的western-blot，那么這篇文章，你一定得看。
選對凝膠很重要
3種常見的凝膠包括Tris-Glycine, Bis-Tris and Tris-Acetate. Tris-Glycine凝膠的PH為8.6，且保質(zhì)期很短。在跑膠的過程中，PH還有上升的趨勢，可達(dá)到9.5。這會導(dǎo)致蛋白降解和低分辨率。
Bis-Tris凝膠的PH為6.4，相對Tris-Glycine凝膠，穩(wěn)定性和保質(zhì)期都有所增加。但這種凝膠需要在溶液中增加抗氧化劑，比如DTT，以維持蛋白的還原性。
Tris-Acetate 凝膠的PH為7，跑大分子蛋白會呈現(xiàn)很高的分辨率。 跑大分子蛋白時，我們推薦使用Tris-Acetate 凝膠。
凝膠濃度很重要
既然選擇了Tris-Acetate 凝膠，還有幾個要考慮的問題。凝膠濃度與孔徑成反比：濃度越小，孔越大。較大的蛋白質(zhì)容易通過較大的孔，所以我建議使用低百分比的凝膠，如7％?？梢允褂锰荻饶z或非梯度凝膠，梯度凝膠適合新樣本。
提高轉(zhuǎn)移buffer中的SDS，減少甲醇
轉(zhuǎn)移buffer的組成至關(guān)重要。如果有甲醇存在，大分子蛋白很容易沉淀。通過減少轉(zhuǎn)移buffer中的甲醇百分比（10％或低）來避免這種情況發(fā)生。 為了進(jìn)一步確保蛋白質(zhì)不會沉淀，考慮添加SDS至終濃度為0.1％。SDS向蛋白添加均勻的負(fù)電荷，使得它們?nèi)菀讖哪z轉(zhuǎn)移到膜上。
選擇合適的膜
膜一般有PVDF膜或NC膜。跑大分子蛋白選擇PVDF膜。如前面所說，如果有甲醇存在，大分子蛋白很容易沉淀。而PVDF膜不需要在轉(zhuǎn)移buffer中添加甲醇，目的蛋白轉(zhuǎn)印的機會高。兩種類型的膜都有各種孔徑尺寸，常見的是0.2um和0.45um。與凝膠一樣，較大的蛋白比較小的容易穿過大孔隙。大多數(shù)蛋白質(zhì)（> 20kDa）可以用0.45um膜轉(zhuǎn)移，避免使用0.2um孔徑。
增加轉(zhuǎn)印時間
在正確的選擇完凝膠、轉(zhuǎn)印膜及轉(zhuǎn)移buffer后，轉(zhuǎn)印正式開始。半干轉(zhuǎn)快且方便，但不適用于大分子蛋白。我建議濕轉(zhuǎn)，因為大分子蛋白轉(zhuǎn)移時間很慢，推薦350-400 mA轉(zhuǎn)移90min或 4°C，40 mA，轉(zhuǎn)印過夜。
